Определение мочевины по Конвею (Conway)

 

Принцип определения: под влиянием фермента уреазы мочевина превращается в углекислый аммоний, из которого под действием щелочи вытесняется аммиак. Последний связывается кислотой. О количестве мочевины судят по количеству кислоты, истраченной на связывание выделенного аммиака.

Все реакции происходят в герметически закрытом сосуде-камере или чашке Конвея.

Рис. Модифицированный прибор Конвея для микродиффузионного определения аммиака в моче и крови.

Камера Конвея готовится из парафина. Она состоит из двух вставленных друг в друга цилиндров. Диаметр наружного цилиндра 75 мм, а внутреннего 30 мм. Высота наружного цилиндра 15 мм, а внутреннего 10 мм. Посредством двух радиальных перегородок, высота которых равна высоте наружного цилиндра, пространство между цилиндрами разделяется на два равных отдела.

Реактивы:

1) 10% раствор уреазы, изготовляемый ex tempore из соевых бобов. Бобы размельчают и 5 г полученной муки растирают в ступке с 50 мл дистиллированной воды до получения гомогенной эмульсии. Осадок отделяют центрифугированием;

2) насыщенный раствор К 2 С0 3 (105,6 г на 200 мл дистиллированной воды);

3) точный 0.01 N раствор H 2 S 0 4 ;

4) точный 0,005 N раствор NaOH;

5) индикатор Джонсона - Грина получается смешиванием 3 ч. спиртового раствора метилрота (1 г на 100 мл 50% спирта) и 1 ч. спиртового раствора метиленблау (0.025 г в 100 мл 50% спирта).

Реактивы рассчитаны на концентрацию мочевины в исследуемой жидкости, не превышающую 50 мг%. Поэтому при наличии данных в пользу более высокого содержания мочевины в исследуемой жидкости необходимо произвести предварительное разведение.

В один из отделов наружного кольца при помощи пипетки вносят 0,5 мл исследуемого раствора и на некотором расстоянии помещают 0,5 мл раствора уреазы. В другой отсек того же кольца отмеривают 1 мл насыщенного раствора К 2 С0 3 - Во внутренний цилиндр наливают точно 1 мл 0,01% раствора H 2 S 0 4 . После этого нагретое стекло прижимают к открытой стенке чашки и герметически ее запаивают. Осторожным покачиванием сливают исследуемую жидкость с уреазой. Ферментативный процесс расщепления мочевины при комнатной температуре заканчивается через 60-90 минут. По истечении этого срока осторожным покачиванием закрытой чашки смешивают содержимое обоих отделов ее наружного кольца. При атом из углекислого аммония вытесняется аммиак, который диффундирует во внутренний цилиндр, где поглощается кислотой. Этот процесс длится около 20 часов. Затем чашку открывают и титруют кислоту щелочью. При этом пользуются индикатором Джонсона -Грина. Конец реакции отчетливо определяется по переходу от фиолетово-розовой окраски к зеленой. Во избежание возможной ошибки за счет присутствия свободного аммиака в исследуемом субстрате или в соевой эмульсии проводятся два контрольных определения.

Для установления содержания NH 3 в уреазе используется тот же порядок определения, но исследуемый субстрат заменяется водой. Для определения аммиака в исследуемой жидкости поступают таким же образом, но уреаза не добавляется. Для выяснения истинного количества аммиака, образовавшегося за счет разложения мочевины, из результатов первого «опытного» определения вычитают результаты обоих контрольных опытов.

Мочевина (в мг%) определяется по формуле:

количество кислоты х 0,14 х 2,12 х 2 х разведение.

Метод отличается высокой точностью и обладает тем преимуществом, что лишен ошибки, происходящей за счет других соединений, содержащих аминогруппы.